【生物菌培养技术培训，生物菌发酵设备技术转让】

   采用摇瓶培养液体菌种时，可以采用往复式摇床或者旋转式摇床。往复式摇床的往复频率一般在80～140r/min，冲程一般为5～14cm，在频率过快、冲程过大或瓶内液体过多时，振荡使液体容易溅到瓶口纱布上而造成污染。旋转式摇床的偏心距一般为3～6cm，旋转次数为60～300r/min，它的结构比较复杂，加工安装要求比往复式摇床高，造价也较贵，但是氧的传递好、功率消耗低，培养基一般不会溅到棉塞上。因此，要根据实际需要选择合适的摇床及振荡速度。

    1．摇瓶培养的工艺流程 制备培养基一分装一灭菌一冷却一接种一摇床培养一一级液体菌种一二级液体菌种。

    2．摇瓶培养要点

    (1)培养基的配制 按配方称好各种成分，装入容器中，加水溶解后，分装入三角瓶中，一般250～300mL三角瓶装50mL培养液，500mL三角瓶装100mL培养液，塞上棉塞，用报纸包扎；也可用8层纱布做成8cm×8cm的瓶塞封口，外面用牛皮纸封口。

    (2)灭菌一般采用高压灭菌方法，灭菌要求121℃、30min。取出冷却到30℃左右，放人无菌室或接种箱内备用。

    (3)接种 按无菌操作要求每瓶接入2～3cm2的斜面菌种一块，每支斜面菌种可接4～5瓶。接入的菌种稍带点培养基为好，能使其浮在培养基的表面，接种后用原塞瓶口的纱布展开后盖在瓶口，并用线绳扎牢。

    (4)培养接种好的菌种瓶可置于摇床上培养，也可置于24～26℃恒温下静置培养48h后，待气生菌丝延伸到培养液中后再进行振荡培养。往复式摇床的振荡频率为80～120r/min，旋转式摇床的频率为150～220r/min，摇床培养3～4d即可。培养结束时，因菌种不同，培养液出现不同色泽，如平菇、金针菇的培养液呈浅黄色；香菇、猴头菇的培养液呈红棕色，并有菇香味；木耳的培养液呈褐色，黏稠有香甜味。培养液经检测，无杂菌污染，菌丝干重达10g/L，菌丝球直径在1～2mm时，方可用于生产或进一步扩大培养。

    (5)二级液体菌种制作 二级液体菌种培养基的制作同一级液体菌种，培养容器要大些，可采用5000mL三角瓶，装量不超过3500mL。灭菌冷却后，将已经发酵好的一级液体菌种按5%～10%的比例接入5000mL三角瓶中，置摇床上培养，转速要适当慢些。经过一定时间的振荡培养，就可得到菌球均匀分布、发酵液清澈透明的液体菌种。

    3．影响摇瓶培养的因素

    (1)培养温度食用菌菌丝的增殖及次级代谢产物的产生都在各种酶的催化下进行，而酶的催化反应需要适宜的温度，多数食用菌的适温度在22～30℃范围内。如香菇为25～26℃，金针菇、平菇为22～25℃，灵芝为28～30℃，云芝为30～31℃，猴头菇为24～26℃。培养温度过低，菌丝生长缓慢；培养温度过高，菌丝球松散、稀疏、活力降低、质量变差。

    (2)摇床的振荡频率和摇瓶的装液量摇床的振荡频率和摇瓶的装液量直接影响到培养液中氧气的含量。摇床的振荡频率越高，摇瓶的装液量越少，则培养液中溶解氧的含量往往越高。

    (3)培养液酸碱度培养液的酸碱度直接影响营养物质吸收、酶活性及菌丝球生长等。培养液的酸碱度必须在灭菌前调整合适。大多数药用真菌的液体发酵，多采用自然pH或控制在pH5. 0～6.5的范围内。如果需要对培养液pH进行调节，可采用低浓度氢氧化钠及盐酸进行。为了防止培养液中酸碱度的剧烈变化，也常在培养液中加入碳酸钙、磷酸盐等缓冲物质。

    培养液的酸碱度一般会随着菌体的生长而变化。发酵培养到了中期，多数菌丝会产生一些酸性物质如乙酸、柠檬酸、草酸等造成培养液pH下降；到了发酵后期，有的菌种菌液中pH会回升。一些无机盐，如碳酸铵被菌丝利用后，会引起pH值下降。葡萄糖作为碳源时，因丙酮酸迅速积累，会引起pH下降；而以乳糖为碳源时因乳糖的吸收较缓慢，pH下降较慢。因此，测定不同菌龄时培养液的pH，对了解菌丝的生长、代谢、生理生化反应等是一项重要的参数。要精确测定pH，可用酸度计进行，也可用pH试纸先进行粗测。摇瓶培养的pH测定必须将菌液倒出测定。

    (4)接入菌种的菌龄接入菌种的菌龄可以影响到摇瓶培养的结果。如菌种老化，则生活力降低，摇瓶中菌体的生长速度减弱，形成的菌丝球减少，培养的液体菌种的质量则较差。所以，应当选择生活力旺盛，生长健壮的试管斜面菌种进行摇瓶培养；如果是二级液体菌种制作，则接入的液体菌种的菌龄也不应老化。

    (5)接种量摇瓶培养的接种量指一级摇瓶种子对二级摇瓶所接入菌液量与培养液的比值。如对二级摇瓶1000mL的培养液中接入50mL的菌液，称接种量为5%。这种接种量的计量方法比较粗糙，并不精确。理论上应以接入菌丝的克数来计量。但在实际操作中因步骤繁杂、易污染而难以实现。一般来讲，摇瓶培养的接种量越大，培养周期越短，反之则长。食（药）用菌液体发酵的接种量一般在5%～30%，但接种量并非越大越好。例如银耳孢子的液体发酵，其适接种量为5%～10%。生产上的佳接种量是以目的物的产量及生产成本综合考虑的结果。此外，接入菌液的菌丝状态将显著影响菌丝的增殖及次生代谢产物的产生。一般可采用匀浆器将菌球打碎成菌丝片段或在摇瓶中加入玻璃球将菌球分散，菌种接入后方能显出迅速的增殖效果。

    (6)培养液黏度 培养液黏度小，形成的菌丝球大，数量少，而黏度增加时，菌丝球直径下降，数量增多，产量增加。因而要根据液体菌种对菌丝球直径的要求，配制一定黏度的培养液，在生产中常加入琼脂和玉米粉增加黏度。

    (7)光照 菌丝生长阶段对光线的需要量不高，应尽量避免直射光的照射。